Examen du liquide céphalo-rachidien (LCR)

Conditions de prélèvement

Le prélèvement est réalisé le plus souvent en urgence (éventuellement après étude du fond d'œil). Le patient doit s'allonger sur un côté et courber le dos (en repliant les genoux vers la poitrine). Une anesthésie locale peut être réalisée. Le LCR est prélevé par ponction au niveau des vertèbres lombaires à l'aide d'une aiguille à ponction lombaire. Quelques millilitres de LCR sont prélevés et rapidement amenés au laboratoire pour être analysés.

Il est souhaitable d'effectuer le prélèvement avant d'instaurer un traitement antibiotique.

Intérêt de l'examen

L'examen du LCR permet le diagnostic de méningite aiguë. Il est réalisé en urgence lorsqu'une méningite est suspectée. Il peut être également nécessaire au diagnostic d'autres infections du système nerveux central : méningo-encéphalites, abcès cérébraux, myélites.

L'analyse du LCR comporte plusieurs aspects :

• Analyse cytologique :recherche de cellules, en particulier globules blancs ;
• Analyse chimique : dosage du glucose, des protéines, des ions chlorure ;
• Analyse bactériologique : mise en culture pour identifier un éventuel germe en cause et réaliser un antibiogramme pour savoir quels antibiotiques seront efficaces sur ce germe.

Résultat normal

LCR d'aspect clair
0 - 2 cellules / mm3
Protéines : 0.20 - 0.40 g /l
Glucose : 50 % de la glycémie (taux de glucose dans le sang)
Examen direct bactériologique négatif et culture négative

Aspect	Cellules /mm3	Protéines (g/l)	Glucose LCR Glucose sang	Culture bactérienne	Interprétation
Clair	5 - 300 lymphocytes	< 1	= 0.5	0 ou Listeria ou spirochète	Méningite virale Méningite à Listeria ou spirochète
Clair	100 - 200 lymphocytes	> 1	< 0.5	0 ou bacille tuberculeux ou cryptocoque	Méningite tuberculeuse ou fongique (champignon)
Trouble purulent	> 200 neutrophiles	> 1	< 0.5	+ (méningocoque, pneumocoque, Haemophilus…)	Méningite bactérienne
Jaune /rouge	Hématies nombreuses		< 0.5	bacille tuberculeux	Tuberculose

Résultats pathologiques

Méningites :

Autres cas de LCR pathologiques

Hémorragie méningée

Méningo-encéphalite :

• Virale : virus du groupe Herpès, entérovirus, virus de la rougeole, rubéole, oreillons, grippe, rage, fièvres hémorragiques…
• Bactérienne : Listeria, bacille tuberculeux, leptospires, Chlamidia, Brucella…
• Fongique ou parasitaire : Plasmodium, cryptocoque, toxoplasme...
• Abcès cérébral.

Définitions

                                   

1/Stérile : exempt de microorganisme ou désinfecté, c’est-à-dire dépourvu de risques de prolifération de micro-organismes.

2/Les milieux de culture :

Milieu sélectif

Un milieu sélectif est un milieu qui permet de sélectionner le type de bactéries qui pourront pousser sur celui-ci, il contient des sels, des colorants ou d’autres substances qui inhibent le développement des autres microorganismes indésirable

Les principaux facteurs de sélection microbienne utilisés seuls ou en association sont:

·         La température d'incubation

·         Le pH du milieu

·         La faculté d'utiliser une source nutritive déterminée (azote, carbone)

·         La résistance à l'action bactéricide d'un antiseptique ou d'un antibiotique

Milieu différentiel

Le milieu de culture dit différentiel ou indicateur' permet de distinguer deux types de microorganismes se développant dans un même milieu. Ce type de milieu est utilisé pour la détection de microorganismes recombinant dans des lignées bactériennes.

Milieu d’enrichissement

Un Milieu d’enrichissement sert à stimuler la croissance d’un microorganisme donné présent initialement en petite quantité dans échantillon ou dans un milieu de culture mixte

Milieu caractéristique

Sont des milieux caractérisé par :

§  Une couleur caractéristique, liée à un indicateur de pH,

§  une composition minimale en acides aminés,

§  un pH particulier,

§  un pouvoir tampon,

§  une richesse en minéraux/oligo-éléments,

§  une richesse en glucose.

Pour le biologiste, il est absolument nécessaire de connaître les couleurs associées aux différents pH pour le milieu de culture : l'acidification du milieu est le premier signe de contamination bactérienne ou d’un dé privation du milieu en nutriments

3/Les bactérie :

Les bactéries pathogènes

Sont des bactéries responsables d'une maladie qui provoquent un ensemble de troubles spécifiques chez un hôte infecté.

 Les bactéries commensales

Sont des bactéries qui colonisent l'organisme (généralement la peau ou les muqueuses) sans provoquer de maladie. Celles-ci jouent un rôle dans les défenses du corps humain. En effet ces, grâce à un effet barrière, empêchent l'installation des bactéries pathogènes .C'est le cas par exemple des staphylocoques et des streptocoques habituellement présents sur la peau ou les muqueuses.
Elles  peuvent devenir pathogènes pour le sujet immunodéprimé. 

Les bactéries saprophytes

La bactérie saprophyte est une bactérie qui tire des matières organiques en décomposition, les substances qui lui sont nécessaires, devenant pathogène pour un individu qui l'hébergeait Au moment où baissent les défenses immunitaires d’individu, la bactérie opportuniste devient subitement dangereuse, occasionnant une infection dite opportuniste

Les bactérie parasite

La bactérie parasite est une bactérie  qui se nourrit, s'abrite ou se reproduit en établissant une interaction durable avec un autre organisme (l'hôte). La relation hôte/parasite n'est pas nécessairement délétère pour l'hôte, comme dans le cas du commensalisme.

4/Coloration de Ziehl-Neelsen

La coloration de Ziehl-Neelsen est une méthode de coloration permettant l'identification des mycobactéries au microscope. Elle fait partie des colorations qui mettent en évidence l'acido-alcoolo-résistance, caractère fondamental des mycobactéries, en prenant en compte la difficulté de pénétration des colorants.

Ce type de coloration comporte trois temps :

·         l'application d'un colorant énergique à chaud ou à froid ;

·         les décolorations successives par un acide fort puis à l'alcool à 90°;

·         une recoloration de contraste.

Le premier colorant utilisé dans les techniques classiques est la fuchsine concentrée. Un fluorochrome, l'auramine, est quant à lui utilisé pour les techniques en fluorescence.

La technique décrite ici est la technique classique de référence. Cependant, elle est de moins en moins utilisée en raison des risques qu'elle fait prendre au manipulateur. En effet, les colorants tels que la fuchsine sont hautement toxiques et cancérigènes, tout particulièrement lorsqu'ils sont utilisés à chaud (à cause des vapeurs).

·         1er temps : coloration par la fuchsine à chaud

o    On recouvre le frottis d'un papier filtre imprégné de fuchsine de Ziehl.

o    Chauffage à émission de vapeur pendant dix minutes au moins, en veillant à ne pas laisser sécher le papier. Rinçage à l'eau distillée stérile.

·         2ème temps : décoloration

o    Trempage de la lame deux minutes dans une solution d'acide, suivi d'un rinçage.

o    Trempage la lame cinq minutes dans l'alcool à 90°, suivi d'un rinçage.

·         3ème temps : recoloration

o    On recouvre la lame pendant deux minutes d'une solution de bleu de méthylène, puis on rince.

L'observation s'effectue au microscope optique, avec objectif à immersion. Les mycobactéries apparaissent alors comme des bacilles rouges sur fond bleu-gris.

Techniques de coloration alternatives

Il existe aujourd'hui des colorations alternatives inspirées de la technique de la coloration de Ziehl-Neelsen, mais présentant des risques moindres pour les manipulateurs :

·         la coloration de Kinyoun

·         la coloration à l'auramine

Les chromoprotéines

Les chromoprotéines

1/ Chromoprotéines porphyrinique:                   

1.1/Pigments respiratoire:

* Les cytochromes :

 sont des coenzymes intermédiaires de la chaîne respiratoire. Ils ont comme caractéristique commune d'être constitués d'une porphyrine complexée avec un atome de fer ou de cuivre. C'est ce dernier qui confère au coenzyme ses propriétés oxydoréductrices en changeant de valence.

Le couple oxydant/réducteur est le suivant : 

Les noyaux porphyrine sont fixés par des liaisons covalentes à la partie protéique des cytochromes 

* Les enzymes héménique :

A/ La catalase

 est formée de quatre chaînes polypeptidiques d’environ 500 acides aminés, comportant chacune un groupe hème. Ces hèmes et leur environnement protéique sont les sites actifs de cette enzyme.

Elle catalyse la décomposition du péroxyde d'hydrogène H2O2 en H2O et O2.
On trouve la catalase dans les peroxysomes, où les réactions d'oxydations produisent H2O2, puissant oxydant, toxique pour la cellule : la catalase détruit H2O2 au fur et à mesure de sa formation.

B/ Peroxydase

Une enzyme de type oxydase qui typiquement catalyse une réaction de la forme :

AH₂ + H₂O₂ → A + 2 H₂O

ROOR' + 2 e^- + 2H⁺ → ROH + R'OH

Les péroxydases sont les enzymes parmi les plus universelles du monde vivant. Dans l'organisme, les péroxydases décomposent notamment les composés péroxydes, toxiques.

En chimie et biochimie, les péroxydases sont très utilisées comme objet d'étude et réactifs pour des synthèses.

1.2/Pigments non respiratoire:

* Phycobilines

Toutes les phycobilines absorbent de l’énergie d’excitation mais la fluorescence de la protéine est due aux chromophores qui absorbent le plus loin dans le spectre lumineux. Les phycobilines qui absorbent l’énergie d’excitation pour la transférer sont des chromophores dits « donneurs » alors que les bilines qui reçoivent l’énergie et fluorescent son appelées « accepteurs ».

2/Chromoprotéines non  porphyrinique:

2.1/Pigments respiratoire:

* L'hémocyanine :

 est une protéine oligomérique servant au transport de l'oxygène chez certains invertébrés, comme les arthropodes et les mollusques. Le site actif de la molécule contient deux atomes de cuivre. C'est ce cuivre sous forme oxydée qui donne au sang de ces animaux une couleur bleue/vert.

L'hémocyanine constitue l'équivalent chez ces animaux de l'hémoglobine chez les vertébrés, qui contient du fer oxydé donnant au sang des vertébrés sa couleur rouge.

C’est-à-dire qui est la protéine responsable du transport de l’oxygène dans l’hémolymphe de

Plusieurs espèces de crabes, mollusques, crustacés, et autres invertébrés marins

2.2/Pigments non respiratoire:

* Les caroténoprotéine

Chez les Crustacés de grande taille la crustacyanine, responsable de la couleur bleue

* Flavoprotéine

Classe de transporteur dans la chaîne de transport des électrons. protéine qui contient de la flavine, coenzyme dérivée d'une vitamine B₂, la riboflavine

La NADH ferricyanure réductase est une flavoprotéine membranaire impliquée notamment dans la désaturation de l'acide oléique en acide linoléique.

* Les métalloprotéines

La nature utilise souvent les métalloprotéines comme catalyseurs : une protéine possédant une activité catalytique est une (ou un) enzyme.

Les cations métalliques sont essentiels pour réaliser dans les organismes vivants une chimie d'oxydo-réduction (qui implique des transferts d'électrons). En effet seuls les éléments métalliques présentent une large gamme d'états d'oxydation. Parfois l'ion métallique peut servir à catalyser des réactions d'hydrolyse ou a uniquement un rôle structural.